Автор статьи: Иван Галак, г. Чита, Читинская государственная медицинская академия.
Применение и принцип метода #
Центрифугирование крови в градиенте плотности применяется для выделения из неё относительно чистых лимфоцитов и гранулоцитов. Существует большое количество различных методик, они отличаются между собой по исходному объёму крови, по плотности градиента и по другим критериям.
Центрифугирование в двойном градиенте позволяет одновременно выделить фракцию лимфоцитов и гранулоцитов, а сам градиент состоит из раствора фиколла (плотность 1,077) и раствора рентгеноконтрастного вещества — урографина или верографина (плотность 1,097).
Чистота выделяемых фракций #
Выделенные таким способом клетки не всегда достаточно чистые, особенно фракция лимфоцитов, которая всегда загрязнена тромбоцитами, моноцитами, а также небольшим количеством гранулоцитов низкой плотности. Фракция гранулоцитов может быть загрязнена эритроцитами — такие эритроциты называют остаточными, они не ушли полностью в осадок при центрифугировании.
Методика #
Стабилизированную ЭДТА, цитратом натрия или гепарином кровь центрифугировать 10 минут при 1500 об/мин для получения богатой тромбоцитами плазмы. Максимально возможный объём тромбоцитарной плазмы удалить и заместить фосфатно-солевым буфером (pH 7,4).
Рекомендуется добавление большего количества буфера (кровь : буфер = 2 : 1) для снижения вязкости крови — это облегчает наслоение крови на градиент. Добавление большего объёма также позволяет получить более чистые фракции по сравнению с неразбавленной кровью.
Раствор урографина в объёме 2 мл налить в пластиковую центрифужную пробирку, аккуратно наслоить 2 мл раствора фиколла. Важно: растворы не должны смешиваться друг с другом. На полученный градиент наслоить 2 мл подготовленной крови и центрифугировать 35 минут при 1500 об/мин. Температурный режим 20–25 °C.
После центрифугирования происходит разделение крови на несколько фракций: плазма, кольцо мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты), слой градиента, кольцо гранулоцитов, слой градиента и осадок из эритроцитов.
Выделение и обработка фракций #
Фракции с мононуклеарами и гранулоцитами аккуратно перенести в пластиковые пробирки. В пробирку с гранулоцитами добавить 2 мл лизирующего раствора для лизиса остаточных эритроцитов. В обе пробирки добавить по 5–10 мл фосфатного буфера и отмыть; процедуру повторить трижды.
Особенности очистки фракций #
Полностью очистить фракцию лимфоцитов от тромбоцитов крайне сложно, но можно снизить их количество путём отбора богатой тромбоцитами плазмы при подготовке крови и трёхкратным промыванием выделенной фракции.
Возможно загрязнение фракции мононуклеарных клеток гранулоцитами низкой плотности, особенно при использовании крови пациентов с тяжёлыми бактериальными инфекциями. Если есть необходимость, можно произвести очистку от гранулоцитов с помощью сортировки клеток с магнитной активацией.
Благодарности #
Благодарю за любезную помощь в публикации статьи на сайте врача клинической лабораторной диагностики Зайцева Евгения Геннадьевича.
